離心機(jī)用于質(zhì)粒DNA的提取

時(shí)間：2015年12月22日信息來源：湘智離心機(jī) 字體：大中小【打印此頁】

    實(shí)驗(yàn)簡介
    質(zhì)粒DNA是存在于細(xì)菌染色體外的一個(gè)或多個(gè)能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。基因克隆實(shí)驗(yàn)中常將質(zhì)粒作為攜帶目的基因的載體。目前從細(xì)菌中提取質(zhì)粒DNA多采用堿裂解法,該法操作簡便，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)將具體實(shí)驗(yàn)操作介紹如下：
    實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器：

用于質(zhì)粒DNA的提取的離心機(jī)     離心機(jī)     電泳設(shè)備
    凝膠成像系統(tǒng)
    1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
    用酒精棉球?qū)?shí)驗(yàn)操作臺進(jìn)行擦拭即可.
    2 菌體收集
    用1.5mlEP管對過夜培養(yǎng)的大腸桿菌進(jìn)行菌體收集，收集兩次約2.5ml過夜培養(yǎng)的菌液（有時(shí)根據(jù)菌液濃度適當(dāng)調(diào)整）；取過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機(jī)，12,000 rpm離心1 分鐘，后倒掉上清，進(jìn)行第二次收集，重復(fù)第一次實(shí)驗(yàn)操作；
    3 菌體重懸
    向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μl 溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），使用200ul移液槍徹底懸浮細(xì)菌沉淀。注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。
    4 菌體裂解
    向離心管中加入250 μl 溶液P2，及時(shí)溫和地上下翻轉(zhuǎn)3-4次使菌體充分裂解，要及時(shí)，是防止局部裂解。注意：溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗帲悦獯驍嗷蚪MDNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA 片斷。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過5 分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
    5 中和反應(yīng)
    向離心管中加入350 μl 溶液P3（主要是些NacooH，中和溶液2中的堿），立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)3-4 次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。注意：P3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
    6 柱子平衡
    拿出吸附柱和收集管，將吸附柱套入入收集管中，向吸附柱CP3 中加入500μl 的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當(dāng)天處理過的柱子）
    7 離心去除沉淀
    將第五步驟中和反應(yīng)后的溶液，用12,000 rpm (~13,400×g )離心15 分鐘去除菌體裂解后的殘留蛋白和基因組DNA，時(shí)其在離心管底部形成沉淀，質(zhì)粒分布于上清液。
    8 質(zhì)粒過柱純化
    將上一步收集的上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要轉(zhuǎn)移出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)離心30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中。
    9 漂洗
    向吸附柱CP3 中加入600 μl 漂洗液PW（檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )離心30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。（一般漂洗兩次）。
    10 空甩
    一般在漂洗后要進(jìn)行一次的空甩，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，具體是12,000 rpm (~13,400×g) 空甩離心2 分鐘，后置于室溫放置數(shù)分鐘。
    11 洗脫DNA
    取干凈的離心管，將吸附柱CP3 置于干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50μl事先溫浴的洗脫緩沖液，室溫放置2 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g) 離心1 分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
    12 瓊脂糖電泳檢測提取質(zhì)粒質(zhì)量
    事先配制好1%濃度的瓊脂糖電泳凝膠。取3ul上步驟提取的質(zhì)粒，點(diǎn)樣，200V電壓電泳15min，后于成像系統(tǒng)觀察。

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