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離心機向土壤DNA進軍

時間:2015年12月22日 信息來源:湘智離心機 字體: 打印此頁

      1.稱取樣品土樣5g,加入滅菌的石英砂,不要液氮研磨,這樣子對DNA傷害很大,幾乎全部片段化了。可以在這步加上PBS洗滌下土壤,一是能夠去除些雜質,二是能夠使得土壤處于懸浮狀態,然后可以在渦旋儀上劇烈渦旋2-3min,使得土壤顆粒破碎。然后用土壤離心機12000rpm離心5min,棄上清。

      2.加入13.5mL的DNA提取Buffer,100微升20mg/mL蛋白酶K,37℃225rpm搖2h;

      3.加入700微升20%SDS,65℃水浴2h,間隔15min顛倒搖勻數次;

      4.6000rpm室溫離心15min,收集中間液相層;向沉淀中加入3mLDNA提取液,300微升20%SDS,65℃水浴30min,同上離心,收集中間液相層,合并;重復一次;這里可以考慮再增加抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后實在裝不下了可以分在兩個50mL離心管里面離心。

      5.向收集的液相層中加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次,8000rpm離心10min,收集上部液相層;在做抽提的時候加用一步酚氯仿,原因是酚能夠更好的使蛋白變性。如果不考慮用酚的話,建議用氯仿異戊醇抽提兩次。會發現顏色會變清不少。

      6.第5步收集液相層中加入0.1倍體積的乙酸鈉,0.6倍體積的異丙醇,室溫放置1-2h;

      7.沉淀物12000rpm離心15min,棄上清;向沉淀中加入10mL冷乙醇洗滌,12000rpm離心5min,棄上清;12000rpm離心30sec,移液槍析出殘留液體;

      8.室溫自然干燥沉淀,干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。沉淀貼壁很緊,不要用小槍頭吹吸攪動,可以將沉淀浸沒后放置于4度過夜或數小時,沉淀就會蓬松。

   土樣比較特殊,黑色,腐殖質等物質含量高,這個必須純化,樣品里面太多的多糖類物質和腐殖質,選擇qiagen的40KB的膠回收試劑盒,嫌太貴的話可以考慮電洗脫。

   DNA提取液組成:100mM Tris,100mMEDTA,200mMNaCl,2%PVPP,3%CTAB,pH9.0
  
   以上為三次提取的詳細過程及試劑用量。

注意事項,所有的槍尖,包括1mL的都要去尖后滅菌。每個步驟動作都要輕柔,這樣DNA才會完整。



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